In dieser Lektion zu mykologischen Laborkenntnissen zeigt unser leitender Mykologe Jonathan Carver, wie man Nährmedien für den Pilzanbau mithilfe von Platten, Schrägagarröhrchen und Flüssigkulturen herstellt. Mit einfachen Techniken zu Hause können auch Sie Kulturen für Ihre Lieblings-Speise-, Gourmet- und Medizinalpilze für den jederzeitigen Zugriff erzeugen. Wir behandeln die notwendigen Inhaltsstoffe und Methoden für jedes Nährmedium sowie deren Anwendungen und warum Sie das eine dem anderen vorziehen sollten. Und obwohl wir in den sterilen Grenzen des Labors gearbeitet haben, um diese Lektion zu erstellen, können dieselben Techniken an eine häusliche Umgebung angepasst werden, indem ein sauberer Arbeitsbereich wie die NocBox verwendet wird.
„In der hart umkämpften Natur sind die Chancen, dass Pilzsporen keimen und dann einen Pilz hervorbringen, gering. In einem Labor, isoliert von luftgetragener Kontamination, verbessert sich die Erfolgswahrscheinlichkeit erheblich. Was ein Züchter tut, ist, eine ausgewählte Art aus dem harten Wettbewerb im Freien in eine optimierte Umgebung in Innenräumen zu bringen, in der das Pilzmyzel ungehindert von den Verwüstungen der Natur wächst. Dieser Hafen der stillen Zuflucht ist im Grunde das sterile Labor.“
–Paul Stamets, "A Simplified Overview of Mushroom Cultivation Strategies"
Video-Anleitung
Hinweis: Wenn Sie Ihr eigenes Medium nicht herstellen möchten, können Sie vorgefertigte Agarplatten und Schrägagarröhrchen über die unten stehenden Links kaufen.
Was sind Platten, Schrägagarröhrchen und Flüssigkulturen?
Platten sind die Arbeitsfläche für die Arbeit mit Pilzen. Sie ermöglichen es Ihnen, Wachstumsmuster und Kolonisierungsgeschwindigkeiten zu beobachten und bieten Ihnen die Möglichkeit, verschiedene Myzelstämme zu trennen, die aus den Sporen eines einzelnen Pilzes isoliert wurden. Platten sind nützlich zum Klonen von Wildpilzstämmen, zum Isolieren von Proben von Kontaminanten und zur Durchführung von Paarungsversuchen zwischen verschiedenen Pilzstämmen. Platten enthalten ein festes Nährmedium, das aus natürlichen Zuckern und Agar besteht, einer gelartigen Substanz, die aus Rotalgen gewonnen wird und dem Myzel bei unserer Arbeit Halt gibt.
Schrägagarröhrchen hingegen sind ideal für die Langzeitlagerung von Kulturen. Die schmale Öffnung eines Reagenzglases ist etwas schwieriger zu handhaben, aber weniger anfällig für Kontaminationen und ermöglicht es Ihnen, einen Pilz auf einer kleinen Menge festen Mediums zu kultivieren, ihn in den Kühlschrank zu stellen und fast unbegrenzt zu lagern, bis Sie ihn benötigen. Oft lagern Sie Ihre Kultur auf Schrägagarröhrchen und übertragen einen kleinen Teil der Kultur vom Schrägagarröhrchen auf eine Kulturplatte, um mit der Arbeit daran zu beginnen.
Wie man Medien für Platten, Schrägagarröhrchen und Flüssigkulturen herstellt
Zunächst ist die Zubereitung von Kulturmedien für Platten, Schrägagarröhrchen und Flüssigkulturen ähnlich, aber im weiteren Verlauf divergieren einige der Techniken. Für Platten verwenden wir das Kulturmedium MYA, kurz für „Malz, Hefe, Agar“, zusammen mit einem Glas PDA, kurz für „Kartoffel, Dextrose, Agar“, für die Herstellung von Schrägagarröhrchen. In MYA liefert Malzextrakt Zucker und Kohlenhydrate, während Hefe zusätzliche Nährstoffe liefert. In der PDA-Lösung dient Dextrose als primäre Nahrungsquelle für das wachsende Myzel, während Kartoffel-Extrakt zusätzliche Nährstoffe liefert. In beiden Präparaten verfestigt Agar das Medium. Für die Flüssigkultur verwenden wir eine einfache Kombination aus Malz und Hefe. Sobald jede Lösung zubereitet ist, pasteurisieren wir sie in einem Schnellkochtopf, um sicherzustellen, dass alle konkurrierenden Mikroben eliminiert werden.
Benötigte Materialien:
- Messzylinder
- Ein Erlenmeyerkolben, Pyrex-Flasche, oder ein Einmachglas mit einem Deckel mit Injektionsport (für Flüssigkultur)
- Heizplatte mit Rührstab
- Ein Schnellkochtopf (z.B. ein All American)
- Timer
- Waage
Benötigte Zutaten:
Platten:
- 500 ml Wasser
- 10 Gramm Malz
- 10 Gramm Agar
- 1 Gramm Hefe
Schrägagar:
- 750 ml Wasser
- 10 Gramm Dextrose
- 10 Gramm Agar
- 2 Gramm Kartoffelextrakt
- Alternativ 30 Gramm PDA-Vormischung
Flüssigkultur:
- 500 ml Wasser
- 10 Gramm Malz
- 1 Gramm Hefe
Schritt 1) Füllen Sie Ihren Kolben, Ihre Pyrexflasche oder Ihr Einmachglas mit der entsprechenden Menge Wasser und stellen Sie es auf eine Heizplatte. Wichtig: Verschließen Sie Ihren Behälter, aber ziehen Sie ihn nicht zu fest an. Dadurch können Druck oder Kondenswasser entweichen. Zum Kochen bringen.
Schritt 2) Während das Wasser erhitzt wird, messen Sie Ihre trockenen Zutaten ab und geben Sie sie gemäß den obigen Rezepten in den jeweiligen Kolben, die Pyrexflasche oder das Glas. Warten Sie, bis sich die Mischung vollständig in Lösung verbunden und auf Temperatur erwärmt hat. Ein optionaler Schritt ist die Verwendung eines biologischen Indikators, um zu bestätigen, dass Ihr Medium ordnungsgemäß sterilisiert ist.
Schritt 3) Sobald Ihre Lösung bereit ist, bereiten Sie den Schnellkochtopf vor. Wir haben einen All American Schnellkochtopf verwendet, aber Sie können für diesen Schritt jeden Schnellkochtopf verwenden, den Sie zu Hause haben, stellen Sie jedoch sicher, dass Sie die Anweisungen für das jeweilige Modell befolgen. Nehmen Sie anschließend Ihre Lösung, überprüfen Sie nochmals, ob sie lose verschlossen ist, und stellen Sie sie hinein. Fügen Sie alle autoklavierbaren Beutel hinzu, die Sie zur Aufbewahrung der Platten verwenden werden, sobald sie gegossen wurden. Verschließen Sie den Schnellkochtopf richtig, indem Sie sicherstellen, dass jede Schraube ausgeglichen ist.
Schritt 4) Stellen Sie einen Timer auf 18 Minuten (zu diesem Zeitpunkt sehen Sie Dampf aufsteigen). Sobald der Timer abgelaufen ist, öffnen Sie den Schnellkochtopf für einige Minuten zum Lüften. Danach verschließen Sie ihn wieder und lassen ihn weitere 18 Minuten laufen. Schnellkochtöpfe variieren, stellen Sie also sicher, dass Sie die Anweisungen befolgen, um sicherzustellen, dass Sie Ihr Medium richtig kochen.
Hinweis zur Laminar Flow Haube
Eine saubere Umgebung ist für die Arbeit mit Kulturmedien unerlässlich, da diese sehr anfällig für Kontaminationen sind. Sie können jedoch Ihr eigenes Wachstumsmedium zu Hause herstellen, indem Sie eine Stillluftbox wie unsere Nocbox beschaffen, die es Ihnen ermöglicht, eine sehr saubere Mikroumgebung zu schaffen. Obwohl dies nicht die empfohlene Technik ist, können Sie Platten auch an der frischen Luft gießen und Kulturen anlegen, aber Ihre Erfolgsquote wird sehr gering sein.
Plattenvorbereitung
Schritt 5) Dieser Vorgang erfordert eine Laminar Flow Haube oder eine NocBox. Sterilisieren Sie Ihren Arbeitsbereich, einschließlich Ihrer Laminar Flow Haube, Handschuhe und Platten. Nehmen Sie Ihr MYA-Medium aus dem Schnellkochtopf (stellen Sie sicher, dass der Druck abgelassen ist) und stellen Sie es in die Laminar Flow Haube. Seien Sie vorsichtig, da Ihr Medium sehr, sehr heiß sein kann. Lassen Sie es abkühlen, bis es sich angenehm anfühlt.
Schritt 6) Sobald Ihr Medium bereit ist, ist es Zeit zum Gießen. Wenn es sich immer noch zu unangenehm anfühlt, können Sie ein steriles Papiertuch um die Flasche wickeln. Beim Gießen beginnen Sie am Boden des Stapels von Petrischalen und arbeiten sich bis nach oben vor, um die Zeit zu minimieren, in der die Innenseite der Platte der offenen Luft ausgesetzt ist. Fahren Sie mit diesem Vorgang fort, bis Sie Ihr gesamtes Medium verbraucht haben.
Schritt 7) Lassen Sie Ihre Platten in der Laminar Flow Haube abkühlen. Sobald sie fest sind, versiegeln Sie sie in einem sterilen Beutel und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Sie können sie auch im Kühlschrank aufbewahren. Die Haltbarkeit beträgt ca. 2 Monate.
Agar in Petrischalen gießen
Kultur auf Schrägagar gewachsen
Schrägagar-Vorbereitung
Schritt 1) Um Schrägagare herzustellen, verwenden Sie eine Pipette, um 20 ml PDA-Medium in jedes Glasröhrchen zu überführen. Achten Sie darauf, jedes Glasröhrchen locker abzudecken.
Schritt 2) Sterilisieren Sie Ihre Röhrchen im Dampfkochtopf bei 15 PSI. Stellen Sie die Zeit auf 15 bis 20 Minuten ein. Auch hier haben wir einen All American Dampfkochtopf verwendet, aber Sie können für diesen Schritt jeden Dampfkochtopf verwenden, den Sie zu Hause haben, stellen Sie jedoch sicher, dass Sie die Anweisungen für das jeweilige Modell befolgen. Fügen Sie dem Dampfkochtopf alle autoklavierbaren Beutel hinzu, die Sie zur Aufbewahrung Ihres Reagenzglasgestells nach vollständiger Pasteurisierung verwenden können.
Schritt 3) Nehmen Sie Ihre Röhrchen aus dem Dampfkochtopf und stellen Sie sie für mindestens 4 Stunden in den Kühlschrank, damit das Medium schräg oder „schräg“ aushärten kann, indem Sie das gesamte Gestell auf ein Objekt wie eine kleine Waage legen, um sicherzustellen, dass die gesamte Charge auf die gleiche Weise aushärtet. Dadurch entsteht eine größere Oberfläche für die Pilzkultur an der Oberfläche des Mediums. Lassen Sie die Kappen locker, während das Medium abkühlt, damit Kondenswasser verdunsten kann, ziehen Sie die Dichtungen jedoch fest, sobald es ausgehärtet ist, um es bis zur Verwendung aufzubewahren.
Vorbereitung von flüssigem Medium
Sobald das flüssige Medium im Schnellkochtopf vollständig pasteurisiert ist, ist es nach dem Abkühlen bereit für die Inokulation. Beachten Sie die entsprechenden sterilen Techniken bei der Verwendung von Kulturspritzen für die Inokulation von flüssigem Kulturmedium.
Zusätze, Antibiotika und Stammseneszens
Es wird empfohlen, die Medien regelmäßig zu wechseln, um die Stammseneszens zu vermeiden. MYA und PDA können austauschbar zwischen Platten und Schrägagaren verwendet werden, während Flüssigkulturen je nach Anwendung von der Zugabe von Zusätzen profitieren können.
Stammseneszens ist der allmähliche Rückgang der Vitalität einer bestimmten Pilzkultur im Laufe der Zeit. Durch den Wechsel des Mediums werden neue Kohlenhydrate eingeführt, die die Produktion verschiedener Enzyme aktivieren und die Lebensfähigkeit des Stammes erhalten.
Einige Mykologen fügen dem Medium auch Zusätze wie Pepton, Gips oder kleine Substratfragmente hinzu, die das Myzelwachstum verbessern, die Stammseneszens vermeiden und in einigen Fällen bestimmte Arten von Pilzkulturen trainieren können, eine spezifische Nahrungsquelle effektiver abzubauen.
Bestimmte Antibiotika, wie Ampicillin und Streptomycin, können auch dem Medium zugesetzt werden, um das Bakterienwachstum zu unterdrücken, wenn Stämme aus der Natur isoliert oder eine kontaminierte Kultur gereinigt wird. Beachten Sie, dass Antibiotika nur verwendet werden sollten, wenn Sie mit einer besonders kontaminationsanfälligen Kultur arbeiten. Darüber hinaus müssen Sie je nach verwendetem Antibiotikum diese vor oder nach dem Kochen Ihres Mediums hinzufügen.
Tipps zur Verwendung von Platten, Schrägagaren und Flüssigkulturen
Durch die Übertragung einer Kultur von Schrägagaren auf Platten können Sie besser mit Ihrer Kultur arbeiten. Ob Sie die Morphologie einer Kultur untersuchen, sie auf Substrat vermehren oder einfach versuchen, eine kontaminierte Kultur zu reinigen, Platten sind bei Laborarbeiten unerlässlich.
Tipps für die Übertragung von Schrägagarkulturen auf Petrischalen:
- Sie benötigen nur eine kleine Gewebeprobe, etwa in der Größe eines Reiskorns, um eine Petrischale zu beimpfen.
- Achten Sie darauf, Ihre Gewebeprobe in die Mitte der Agarplatte zu legen und diese sofort mit Parafilm zu verschließen. Dies reduziert das Kontaminationsrisiko.
- Wenn Sie mehrere Proben entnehmen, sterilisieren Sie Ihre Werkzeuge vor und nach jedem Gebrauch.
- Sobald Sie einen Stapel beimpfter Platten haben, können Sie diese in einem autoklavierbaren Beutel aufbewahren.
- Nachdem Ihre Platten beimpft sind, lassen Sie sie bei Raumtemperatur stehen, damit das Myzel auf der Oberfläche der Platte wachsen kann.
- Sobald Ihre Kultur vollständig bis zum Rand der Platte gewachsen ist, können Sie sie 1-3 Monate lang in einem Kühlschrank aufbewahren.
Übertragung von Petrischalen auf Schrägagarkulturen oder flüssige Nährmedien
Sobald Sie eine besiedelte Platte haben, können Sie diese entweder zur Langzeitlagerung auf Schrägagarkulturen übertragen oder sie zur Beimpfung von flüssigen Kulturmedien verwenden.
Entnahme einer Kultur aus einer Schrägagarkultur
Kultur in einer Agar-Petrischale platziert
Tipps für die Übertragung von Petrischalen auf Schrägagarkulturen oder flüssige Medien:
- Beim Entnehmen von Myzelabschnitten sollten Sie diese aus dem mittleren Bereich der Platte entnehmen. Sie möchten weder in der Nähe der Mitte der Platte noch am äußersten Rand des Myzels sein, da diese Bereiche anfälliger für Verunreinigungen sind.
- Wie bei den Platten sollten Sie auch Agar-Schrägagarkulturen mit Parafilm versiegeln und sie bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Sobald das Myzel die Oberfläche der Schrägagarkultur vollständig bewachsen hat, können Sie diese bis zu einem Jahr im Kühlschrank aufbewahren.
- Sie können auch Platten verwenden, um flüssige Medien zu beimpfen. Nach der Beimpfung benötigt das Myzel einige Wochen, um im gesamten Medium zu wachsen. Nach vollständiger Kolonisierung kann flüssige Kultur verwendet werden, um Brut oder weitere flüssige Kultur zu erzeugen.
Beimpfung flüssiger Medien mit einer Kulturspritze
Die Beimpfung flüssiger Medien mit einer Kultur- oder Sporenspritze ist die gängigste Technik, die von Hobbyanbauern oder Low-Tech-Züchtern verwendet wird, um die Lebensdauer einer einzelnen Spritze mit Flüssigkultur zu verlängern. Einige kommerzielle Züchter verwenden diese Technik ebenfalls, da sie die Möglichkeit der Kontamination begrenzt und einfacher zu handhaben sein kann.
Tipps zur Beimpfung flüssiger Medien mit einer Kulturspritze:
- Obwohl diese Technik auch in nicht-sterilen Umgebungen gut funktionieren kann, wird empfohlen, die Beimpfung entweder in einer Stilluftbox wie der NocBox oder einer Reinraumwerkbank durchzuführen, um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren.
- Stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Nadel vor Gebrauch sterilisieren.
- Es kann schwieriger sein, Kontaminationen in Flüssigkulturen zu erkennen.
Flüssigkeitskultur-Kit
Das Flüssigkeitskultur-Kit von North Spore ermöglicht Pilzzüchtern, eine einzelne 10-ml-Kultur- oder Sporenspritze in 300 ml Kultur umzuwandeln, ohne teure Geräte wie eine Reinraumwerkbank oder ein Labor zu verwenden. Diese speziell formulierte, sterile Nährlösung ist die ideale Umgebung für das Wachstum von Myzel, das zur Beimpfung steriler Substrate wie Kornbeutel, Sägemehlbrut und All-in-One-Beutel wie den ShroomTek verwendet werden kann.
Letzte Gedanken
Das Arbeiten mit Petrischalen, Schrägagarkulturen und Flüssigkulturen zu Hause kann äußerst lohnend sein. Die Entwicklung dieser einzigartigen Fähigkeiten ermöglicht es Ihnen, essbare und Gourmetpilze das ganze Jahr über anzubauen und zu genießen, wodurch Ihre Selbstversorgung steigt und Sie gleichzeitig Geld sparen. Dabei lernen Sie vielleicht sogar etwas Neues über die Natur!
Referenzen:
Ein vereinfachter Überblick über Strategien zur Pilzzucht
https://fungi.com/blogs/articles/a-simplified-overview-of-mushroom-cultivation-strategies