Compétences de laboratoire en mycologie : Boîtes de Pétri, Biais et Culture liquide

Dans cette leçon de laboratoire de mycologie, notre mycologue en chef Jonathan Carver démontre comment produire des milieux de croissance pour la culture de champignons à l'aide de boîtes de Pétri, de tubes inclinés et de cultures liquides. En utilisant des techniques simples à la maison, vous aussi pouvez générer des cultures pour vos champignons gastronomiques et médicinaux préférés, disponibles à tout moment. Nous couvrons les ingrédients et les méthodes nécessaires pour chaque milieu de croissance, ainsi que leurs applications et les raisons pour lesquelles vous choisiriez l'un plutôt que l'autre. Et, bien que nous ayons travaillé dans les limites stériles du laboratoire pour créer cette leçon, ces mêmes techniques peuvent être adaptées à un environnement domestique en utilisant un espace de travail propre comme la NocBox.

Note : Si vous ne souhaitez pas produire votre propre milieu, vous pouvez acheter des boîtes de Pétri et des tubes inclinés prêts à l'emploi en cliquant sur les liens ci-dessous.

Les boîtes de Pétri sont la surface de travail pour la manipulation des champignons. Elles permettent d'observer les schémas de croissance, les vitesses de colonisation et offrent la possibilité de séparer différentes souches de mycélium isolées des spores d'un seul champignon. Les boîtes de Pétri sont utiles pour le clonage de souches de champignons sauvages, l'isolation de spécimens contaminés et la réalisation d'essais de croisement entre différentes souches de champignons. Les boîtes contiennent une culture solide de milieu composé de sucres naturels et d'agar, une substance gélatineuse dérivée d'algues rouges qui fournit une base pour le mycélium pendant notre travail.

Les tubes inclinés, quant à eux, sont idéaux pour le stockage à long terme des cultures. L'ouverture étroite d'un tube à essai est un peu plus difficile à manipuler mais moins sujette à la contamination et permet de cultiver un champignon sur une petite quantité de milieu solide, de le placer au réfrigérateur et de le conserver presque indéfiniment jusqu'à ce que vous en ayez besoin. Souvent, vous stockerez votre culture sur des tubes inclinés et transférerez une petite portion de culture du tube incliné à une boîte de Pétri pour commencer à travailler dessus.

Initialement, la préparation des milieux de culture est similaire pour les boîtes de Pétri, les tubes inclinés et la culture liquide, mais au fur et à mesure que nous avançons vers les étapes ultérieures, certaines techniques divergent. Pour les boîtes de Pétri, nous utiliserons le milieu de culture MYA, abréviation de "malt, levure, agar", ainsi qu'un bocal de PDA, abréviation de "pomme de terre, dextrose, agar", pour la fabrication des tubes inclinés. Dans le MYA, l'extrait de malt fournit des sucres et des glucides, tandis que la levure apporte des nutriments supplémentaires. Dans la solution PDA, le dextrose sert de principale source de nourriture pour le mycélium en croissance, tandis que l'extrait de pomme de terre fournit des nutriments supplémentaires. Dans les deux préparations, l'agar solidifie le milieu. Pour la culture liquide, nous utiliserons une simple combinaison de malt et de levure. Une fois chaque solution préparée, nous les pasteuriserons dans un autocuiseur pour nous assurer que tous les microbes concurrents sont éliminés.

Matériel nécessaire :

• Éprouvette graduée
• Un erlenmeyer, une bouteille Pyrex, ou un bocal Mason avec un couvercle à port d'injection (pour la culture liquide)
• Plaque chauffante avec agitateur magnétique
• Un autocuiseur (tel qu'un All American)
• Minuteur
• Balance

Ingrédients nécessaires :

Étape 1) Remplissez votre fiole, votre bouteille Pyrex ou votre bocal en verre avec la quantité d'eau appropriée et placez-les sur une plaque chauffante. Important : Scellez votre récipient mais ne le serrez pas trop. Cela permet à toute pression ou condensation de s'échapper. Chauffez jusqu'à ébullition.

Étape 2) Pendant que l'eau chauffe, mesurez vos ingrédients secs et ajoutez-les à la fiole, à la bouteille Pyrex ou au bocal approprié, en suivant les recettes ci-dessus. Attendez que le mélange se combine entièrement en solution et chauffe à la température. Une étape facultative consiste à utiliser un indicateur biologique pour confirmer que votre milieu est correctement stérilisé.

Étape 3) Une fois que votre solution est prête, préparez l'autocuiseur. Nous avons utilisé un autocuiseur All American, mais vous pouvez utiliser n'importe quel autocuiseur que vous avez chez vous pour cette étape, mais assurez-vous de suivre les instructions spécifiques au modèle. Ensuite, prenez votre solution, vérifiez qu'elle est couverte sans être serrée, et placez-la à l'intérieur. Incluez tous les sacs autoclavables que vous utiliserez pour stocker les boîtes de Pétri une fois qu'elles auront été coulées. Fermez correctement l'autocuiseur en vous assurant que chaque vis est équilibrée.

Étape 4) Réglez une minuterie sur 18 minutes (à ce moment-là, vous verrez de la vapeur s'échapper). Une fois la minuterie éteinte, ouvrez l'autocuiseur pendant quelques minutes pour l'aérer. Ensuite, scellez-le à nouveau et laissez-le fonctionner pendant 18 minutes supplémentaires. Les autocuiseurs varient, alors assurez-vous de suivre les instructions pour garantir une cuisson correcte de votre milieu.

Préparation du milieu liquide

Une fois le milieu liquide entièrement pasteurisé dans l'autocuiseur, il est prêt pour l'inoculation une fois qu'il a refroidi. Gardez à l'esprit les techniques stériles appropriées lors de l'utilisation de seringues de culture pour l'inoculation du milieu de culture liquide.

Il est recommandé de changer de milieu de temps en temps pour éviter la sénescence de la souche. Le MYA et le PDA peuvent être utilisés de manière interchangeable entre les boîtes et les slants, tandis que la culture liquide peut bénéficier de l'ajout d'amendements en fonction de l'application.

La sénescence de la souche est le déclin graduel de la vigueur d'une culture de champignons particulière au fil du temps. En alternant les milieux, vous introduisez de nouveaux glucides qui aident à activer la production de différentes enzymes et à maintenir la viabilité de la souche.

Certains mycologues peuvent également ajouter des amendements aux milieux tels que : de la peptone, du gypse minéral ou de petits fragments de substrat, ce qui peut aider à améliorer la croissance mycélienne, à éviter la sénescence de la souche et, dans certains cas, à entraîner certains types de cultures de champignons à décomposer plus efficacement une source de nourriture spécifique.

Certains antibiotiques, tels que l'ampicilline et la streptomycine, peuvent également être ajoutés au milieu pour supprimer la croissance bactérienne lors de l'isolement de souches sauvages ou du nettoyage d'une culture contaminée. Gardez à l'esprit que les antibiotiques ne doivent être utilisés que lorsque vous travaillez avec une culture particulièrement sujette à la contamination. De plus, selon l'antibiotique utilisé, vous devrez peut-être les ajouter avant ou après la cuisson de votre milieu.

En transférant une culture des slants aux boîtes de Pétri, vous pourrez mieux travailler avec votre culture. Que vous étudiiez la morphologie d'une culture, que vous la propagiez sur un substrat de reproduction ou que vous essayiez simplement de nettoyer une culture contaminée, les boîtes de Pétri sont essentielles pour le travail en laboratoire.

Conseils pour le transfert des milieux inclinés aux boîtes :

• Il suffit d'un petit échantillon de tissu, de la taille d'un grain de riz, pour ensemencer une boîte.
• Assurez-vous de placer votre échantillon de tissu au centre de la boîte de Pétri d'agar et de le sceller immédiatement à l'aide de parafilm. Cela contribue à réduire la contamination.
• Si vous prélevez plusieurs échantillons, veillez à stériliser vos outils avant et après chaque utilisation.
• Une fois que vous avez une pile de boîtes ensemencées, vous pouvez les stocker dans un sac autoclavable.
• Une fois vos boîtes ensemencées, laissez-les à température ambiante pour permettre au mycélium de se développer à la surface de la boîte.
• Une fois que votre culture a complètement atteint le bord de la boîte, vous pouvez les stocker pendant 1 à 3 mois au réfrigérateur.

Une fois que vous avez une boîte colonisée, vous pouvez soit la transférer sur des milieux inclinés pour un stockage à long terme, soit l'utiliser pour ensemencer des milieux de culture liquides.

Conseils pour le transfert des boîtes aux milieux inclinés ou liquides :

• Lorsque vous prélevez des sections de mycélium, vous voudrez les prendre dans la zone centrale de la boîte. Vous ne voulez pas être près du milieu de la boîte, ni au bord extrême du mycélium, car ces zones sont plus susceptibles de contenir des contaminants.
• Comme pour les boîtes, vous devez sceller les milieux inclinés d'agar avec du parafilm et les laisser incuber à température ambiante. Une fois que le mycélium a complètement recouvert la surface du milieu incliné, vous pouvez les stocker au réfrigérateur pendant un an maximum.
• Vous pouvez également utiliser des boîtes pour ensemencer des milieux liquides. Une fois ensemencé, le mycélium mettra quelques semaines à se développer dans le milieu. Une fois entièrement colonisée, la culture liquide peut être utilisée pour créer du blanc de champignon ou plus de culture liquide.

L'ensemencement de milieux liquides avec une seringue de culture ou de spores est la technique la plus couramment utilisée par les cultivateurs domestiques ou à faible technologie pour prolonger la durée de vie d'une seule seringue de culture liquide. Certains cultivateurs commerciaux utilisent également cette technique, car elle limite les possibilités de contamination et peut être plus facile à travailler.

Conseils pour l'ensemencement de milieux liquides avec une seringue de culture :

• Bien que cette technique puisse bien fonctionner dans des environnements non stériles, il est recommandé d'effectuer l'ensemencement dans une boîte à air calme telle que la NocBox ou une hotte à flux laminaire pour réduire les possibilités de contamination.
• Assurez-vous de stériliser votre aiguille avant utilisation.
• Il peut être plus difficile de repérer la contamination dans les cultures liquides.

Le kit de culture liquide de North Spore permet aux cultivateurs de champignons de transformer une seule seringue de culture ou de spores de 10 ml en 300 ml de culture sans utiliser d'équipement coûteux comme une hotte à flux laminaire ou un laboratoire. Ce bouillon nutritif stérile spécialement formulé est l'environnement idéal pour la croissance du mycélium, qui peut être utilisé pour ensemencer des substrats stériles tels que les sacs de grains, le blanc de champignon de sciure de bois et les sacs tout-en-un comme le ShroomTek.

Travailler avec des boîtes, des milieux inclinés et des cultures liquides à la maison peut être extrêmement gratifiant. Développer ces compétences uniques vous permettra de cultiver et de savourer des champignons comestibles et gastronomiques toute l'année, augmentant ainsi votre autosuffisance tout en vous faisant économiser de l'argent. Vous pourriez même apprendre quelque chose de nouveau sur le monde naturel en le faisant !

Références :

Un aperçu simplifié des stratégies de culture des champignons

https://fungi.com/blogs/articles/a-simplified-overview-of-mushroom-cultivation-strategies

Dans cette leçon de laboratoire de mycologie, notre mycologue en chef Jonathan Carver démontre comment produire des milieux de croissance pour la culture de champignons à l'aide de boîtes de Pétri, de tubes inclinés et de cultures liquides. En utilisant des techniques simples à la maison, vous aussi pouvez générer des cultures pour vos champignons gastronomiques et médicinaux préférés, disponibles à tout moment. Nous couvrons les ingrédients et les méthodes nécessaires pour chaque milieu de croissance, ainsi que leurs applications et les raisons pour lesquelles vous choisiriez l'un plutôt que l'autre. Et, bien que nous ayons travaillé dans les limites stériles du laboratoire pour créer cette leçon, ces mêmes techniques peuvent être adaptées à un environnement domestique en utilisant un espace de travail propre comme la NocBox.

Note : Si vous ne souhaitez pas produire votre propre milieu, vous pouvez acheter des boîtes de Pétri et des tubes inclinés prêts à l'emploi en cliquant sur les liens ci-dessous.

Les boîtes de Pétri sont la surface de travail pour la manipulation des champignons. Elles permettent d'observer les schémas de croissance, les vitesses de colonisation et offrent la possibilité de séparer différentes souches de mycélium isolées des spores d'un seul champignon. Les boîtes de Pétri sont utiles pour le clonage de souches de champignons sauvages, l'isolation de spécimens contaminés et la réalisation d'essais de croisement entre différentes souches de champignons. Les boîtes contiennent une culture solide de milieu composé de sucres naturels et d'agar, une substance gélatineuse dérivée d'algues rouges qui fournit une base pour le mycélium pendant notre travail.

Les tubes inclinés, quant à eux, sont idéaux pour le stockage à long terme des cultures. L'ouverture étroite d'un tube à essai est un peu plus difficile à manipuler mais moins sujette à la contamination et permet de cultiver un champignon sur une petite quantité de milieu solide, de le placer au réfrigérateur et de le conserver presque indéfiniment jusqu'à ce que vous en ayez besoin. Souvent, vous stockerez votre culture sur des tubes inclinés et transférerez une petite portion de culture du tube incliné à une boîte de Pétri pour commencer à travailler dessus.

Initialement, la préparation des milieux de culture est similaire pour les boîtes de Pétri, les tubes inclinés et la culture liquide, mais au fur et à mesure que nous avançons vers les étapes ultérieures, certaines techniques divergent. Pour les boîtes de Pétri, nous utiliserons le milieu de culture MYA, abréviation de "malt, levure, agar", ainsi qu'un bocal de PDA, abréviation de "pomme de terre, dextrose, agar", pour la fabrication des tubes inclinés. Dans le MYA, l'extrait de malt fournit des sucres et des glucides, tandis que la levure apporte des nutriments supplémentaires. Dans la solution PDA, le dextrose sert de principale source de nourriture pour le mycélium en croissance, tandis que l'extrait de pomme de terre fournit des nutriments supplémentaires. Dans les deux préparations, l'agar solidifie le milieu. Pour la culture liquide, nous utiliserons une simple combinaison de malt et de levure. Une fois chaque solution préparée, nous les pasteuriserons dans un autocuiseur pour nous assurer que tous les microbes concurrents sont éliminés.

Matériel nécessaire :

• Éprouvette graduée
• Un erlenmeyer, une bouteille Pyrex, ou un bocal Mason avec un couvercle à port d'injection (pour la culture liquide)
• Plaque chauffante avec agitateur magnétique
• Un autocuiseur (tel qu'un All American)
• Minuteur
• Balance

Ingrédients nécessaires :

Étape 1) Remplissez votre fiole, votre bouteille Pyrex ou votre bocal en verre avec la quantité d'eau appropriée et placez-les sur une plaque chauffante. Important : Scellez votre récipient mais ne le serrez pas trop. Cela permet à toute pression ou condensation de s'échapper. Chauffez jusqu'à ébullition.

Étape 2) Pendant que l'eau chauffe, mesurez vos ingrédients secs et ajoutez-les à la fiole, à la bouteille Pyrex ou au bocal approprié, en suivant les recettes ci-dessus. Attendez que le mélange se combine entièrement en solution et chauffe à la température. Une étape facultative consiste à utiliser un indicateur biologique pour confirmer que votre milieu est correctement stérilisé.

Étape 3) Une fois que votre solution est prête, préparez l'autocuiseur. Nous avons utilisé un autocuiseur All American, mais vous pouvez utiliser n'importe quel autocuiseur que vous avez chez vous pour cette étape, mais assurez-vous de suivre les instructions spécifiques au modèle. Ensuite, prenez votre solution, vérifiez qu'elle est couverte sans être serrée, et placez-la à l'intérieur. Incluez tous les sacs autoclavables que vous utiliserez pour stocker les boîtes de Pétri une fois qu'elles auront été coulées. Fermez correctement l'autocuiseur en vous assurant que chaque vis est équilibrée.

Étape 4) Réglez une minuterie sur 18 minutes (à ce moment-là, vous verrez de la vapeur s'échapper). Une fois la minuterie éteinte, ouvrez l'autocuiseur pendant quelques minutes pour l'aérer. Ensuite, scellez-le à nouveau et laissez-le fonctionner pendant 18 minutes supplémentaires. Les autocuiseurs varient, alors assurez-vous de suivre les instructions pour garantir une cuisson correcte de votre milieu.

Préparation du milieu liquide

Une fois le milieu liquide entièrement pasteurisé dans l'autocuiseur, il est prêt pour l'inoculation une fois qu'il a refroidi. Gardez à l'esprit les techniques stériles appropriées lors de l'utilisation de seringues de culture pour l'inoculation du milieu de culture liquide.

Il est recommandé de changer de milieu de temps en temps pour éviter la sénescence de la souche. Le MYA et le PDA peuvent être utilisés de manière interchangeable entre les boîtes et les slants, tandis que la culture liquide peut bénéficier de l'ajout d'amendements en fonction de l'application.

La sénescence de la souche est le déclin graduel de la vigueur d'une culture de champignons particulière au fil du temps. En alternant les milieux, vous introduisez de nouveaux glucides qui aident à activer la production de différentes enzymes et à maintenir la viabilité de la souche.

Certains mycologues peuvent également ajouter des amendements aux milieux tels que : de la peptone, du gypse minéral ou de petits fragments de substrat, ce qui peut aider à améliorer la croissance mycélienne, à éviter la sénescence de la souche et, dans certains cas, à entraîner certains types de cultures de champignons à décomposer plus efficacement une source de nourriture spécifique.

Certains antibiotiques, tels que l'ampicilline et la streptomycine, peuvent également être ajoutés au milieu pour supprimer la croissance bactérienne lors de l'isolement de souches sauvages ou du nettoyage d'une culture contaminée. Gardez à l'esprit que les antibiotiques ne doivent être utilisés que lorsque vous travaillez avec une culture particulièrement sujette à la contamination. De plus, selon l'antibiotique utilisé, vous devrez peut-être les ajouter avant ou après la cuisson de votre milieu.

En transférant une culture des slants aux boîtes de Pétri, vous pourrez mieux travailler avec votre culture. Que vous étudiiez la morphologie d'une culture, que vous la propagiez sur un substrat de reproduction ou que vous essayiez simplement de nettoyer une culture contaminée, les boîtes de Pétri sont essentielles pour le travail en laboratoire.

Conseils pour le transfert des milieux inclinés aux boîtes :

• Il suffit d'un petit échantillon de tissu, de la taille d'un grain de riz, pour ensemencer une boîte.
• Assurez-vous de placer votre échantillon de tissu au centre de la boîte de Pétri d'agar et de le sceller immédiatement à l'aide de parafilm. Cela contribue à réduire la contamination.
• Si vous prélevez plusieurs échantillons, veillez à stériliser vos outils avant et après chaque utilisation.
• Une fois que vous avez une pile de boîtes ensemencées, vous pouvez les stocker dans un sac autoclavable.
• Une fois vos boîtes ensemencées, laissez-les à température ambiante pour permettre au mycélium de se développer à la surface de la boîte.
• Une fois que votre culture a complètement atteint le bord de la boîte, vous pouvez les stocker pendant 1 à 3 mois au réfrigérateur.

Une fois que vous avez une boîte colonisée, vous pouvez soit la transférer sur des milieux inclinés pour un stockage à long terme, soit l'utiliser pour ensemencer des milieux de culture liquides.

Conseils pour le transfert des boîtes aux milieux inclinés ou liquides :

• Lorsque vous prélevez des sections de mycélium, vous voudrez les prendre dans la zone centrale de la boîte. Vous ne voulez pas être près du milieu de la boîte, ni au bord extrême du mycélium, car ces zones sont plus susceptibles de contenir des contaminants.
• Comme pour les boîtes, vous devez sceller les milieux inclinés d'agar avec du parafilm et les laisser incuber à température ambiante. Une fois que le mycélium a complètement recouvert la surface du milieu incliné, vous pouvez les stocker au réfrigérateur pendant un an maximum.
• Vous pouvez également utiliser des boîtes pour ensemencer des milieux liquides. Une fois ensemencé, le mycélium mettra quelques semaines à se développer dans le milieu. Une fois entièrement colonisée, la culture liquide peut être utilisée pour créer du blanc de champignon ou plus de culture liquide.

L'ensemencement de milieux liquides avec une seringue de culture ou de spores est la technique la plus couramment utilisée par les cultivateurs domestiques ou à faible technologie pour prolonger la durée de vie d'une seule seringue de culture liquide. Certains cultivateurs commerciaux utilisent également cette technique, car elle limite les possibilités de contamination et peut être plus facile à travailler.

Conseils pour l'ensemencement de milieux liquides avec une seringue de culture :

• Bien que cette technique puisse bien fonctionner dans des environnements non stériles, il est recommandé d'effectuer l'ensemencement dans une boîte à air calme telle que la NocBox ou une hotte à flux laminaire pour réduire les possibilités de contamination.
• Assurez-vous de stériliser votre aiguille avant utilisation.
• Il peut être plus difficile de repérer la contamination dans les cultures liquides.

Le kit de culture liquide de North Spore permet aux cultivateurs de champignons de transformer une seule seringue de culture ou de spores de 10 ml en 300 ml de culture sans utiliser d'équipement coûteux comme une hotte à flux laminaire ou un laboratoire. Ce bouillon nutritif stérile spécialement formulé est l'environnement idéal pour la croissance du mycélium, qui peut être utilisé pour ensemencer des substrats stériles tels que les sacs de grains, le blanc de champignon de sciure de bois et les sacs tout-en-un comme le ShroomTek.

Travailler avec des boîtes, des milieux inclinés et des cultures liquides à la maison peut être extrêmement gratifiant. Développer ces compétences uniques vous permettra de cultiver et de savourer des champignons comestibles et gastronomiques toute l'année, augmentant ainsi votre autosuffisance tout en vous faisant économiser de l'argent. Vous pourriez même apprendre quelque chose de nouveau sur le monde naturel en le faisant !

Références :

Un aperçu simplifié des stratégies de culture des champignons

https://fungi.com/blogs/articles/a-simplified-overview-of-mushroom-cultivation-strategies